Konfokale Einzelpartikel-Detektion von fluoreszenz-kodierten Nanospheres

Ziel dieser Arbeit war es, einzelne fluoreszenz-kodierte Nanopartikel von der Größe 20-40 nm bei diffusiven Durchgängen durch ein konfokales Fokalvolumen mit einem Radius von 200-300 nm identifizieren und charakterisieren zu können. Hintergrund hierbei ist, dass durch die Kodierung eine große Anzahl verschiedener Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen in kurzer Zeit in einem einzelnen parallelen Reaktionsansatz untersucht werden kann, was insbesondere bei Massendurchsatzverfahren, wie z.B. der DNA-Analyse oder der Analyse von Glycokonjugaten, von Vorteil ist. Zunächst wurde hierzu eine konfokale Mikroskopapparatur mit einer gepulsten Ti:Sa-Laserquelle zur Zweiphotonen-Anregung aufgebaut und detektionsseitig die emittierte Fluoreszenz in drei spektralen Regionen separat aufgezeichnet. Die aus den Messungen erhaltenen Daten wurden dann mit einer selbst programmierten Software ausgewertet. Für die parallelisierten Messungen mussten effektive Identifikationsalgorithmen programmiert, evaluiert und getestet werden. Hierzu war es erforderlich, zur Differenzierung geeignete Charakteristika der auftretenden Photonenbursts zu finden und die zur Verfügung stehenden Nanopartikel diesbezüglich zu analysieren. Aus den Absorptions- und Emissionsspektren der Partikel zeigte sich bei den mehrfach gefärbten Typen, dass insbesondere bei der Zweiphotonen-Anregung effektiv nur das am langwelligsten emittierende Fluorophor Photonen abgibt. Es stellte sich heraus, dass hierfür effektive Förster-Resonanz-Energietransfer-Prozesse (FRET) verantwortlich sind, die durch große Spektralüberlappungen und kleinen Fluorophorabständen in den Partikeln begünstigt werden. Dadurch, dass die Unterscheidung mehrfach angefärbter Partikeltypen anhand ihrer Fluoreszenzemissionen durch FRET-Prozesse erschwert ist, wurde zunächst die parallele Unterscheidung einfach angefärbter Typen untersucht. Für diese Typen wurden dann über multiple Messungen typenreiner Proben Filterverteilungen der Identifikationsparameter aufgenommen und abgeschätzt, inwiefern die Identifikationsalgorithmen in der Lage sein sollten, sie zu unterscheiden. Um Einflüsse von Burstüberlappungen und peripheren Passagen zu quantifizieren, wurde eine Simulation programmiert und die verschiedenen Algorithmen auf die resultierenden Zeitspuren angewendet. Die Effizienz verschiedener Algorithmen die einzelnen Typen zu differenzieren, wurde dann zunächst an fünf Einpartikelsystemen getestet wobei eine nahezu hundertprozentige Identifikation erreicht wurde. Die Anwendung der Algorithmen auf alle möglichen Permutationen an Mehrkomponentensystemen zeigte teilweise geringfügig höhere Fehlerraten als bei den Einkomponentensystemen, allerdings konnten einzelne Nanopartikel immer noch mit einer Sicherheit von mehr als 95 % identifiziert werden. Bei der Analyse von einzelnen Fluoreszenzbursts konnten weitere interessante Phänomene beobachtet werden. So zeigten Messungen der Fluoreszenzlebensdauer an Ensembles einiger Partikel und bei der Einzelburstfluoreszenzlebensdauer aller Partikel eine Abhängigkeit von der Anregungsleistung. Die Begründung liegt hierbei in der Zunahme äußerst effektiver zusätzlicher FRETWege angeregter Zustände. Darüber hinaus wurden Effekte auf die Fluoreszenzlebensdauer als Funktion der Partikelgröße beobachtet. Der Vergleich von Partikeln verschiedener Größe zeigte eine Reduzierung der Lebensdauer mit zunehmender Partikelgröße, was durch die Veränderung der Populationsverhältnisse zugunsten der schneller relaxierenden Fluorophore im Kugelkern bedingt ist. Weitere Effekte auf die Komponenten der Fluoreszenzabklingdynamiken konnten durch veränderte Geometrie und multiplen Homoenergietransfer erklärt werden. Bei der Autokorrelationsanalyse zeigte sich eine stark typenspezifische Abhängigkeit des Fokalvolumens von der Laserleistung,