Regulation der Jasmonsäure-Synthese durch reversible Dimerisierung der Oxophytodiensäurereduktase 3 (OPR3)

ZUSAMMENFASSUNG Jasmonsäure (JA) ist ein Phytohormon, welches sowohl bei der Regulation abiotischer und biotischer Stressantworten, als auch bei verschiedenen Entwicklungsprozessen der Pflanzen eine wichtige Rolle einnimmt. Die Oxophytodiensäurereduktase 3 (OPR3) ist maßgeblich an der Biosynthese der JA beteiligt und katalysiert dabei einen entscheidenden Schritt in den Peroxisomen: die Umsetzung des JA-Vorläufers 12-Oxophytodiensäure (OPDA) zu OPC-8:0. Nach Verwundung oder Herbivorie akkumulieren innerhalb weniger Minuten JA und ihre bioaktive Form JA-Ile. Diese schnelle und transiente Zunahme könnte durch posttranslationale Aktivierung der JA-Biosyntheseenzyme erklärt werden. Die Beobachtung, dass OPR3 als sich selbst-inhibierendes Dimer kristallisiert, führte zu der Hypothese, dass der rasche JA-Anstieg durch reversible Dimerisierung der OPR3 ermöglicht wird und die Regulation durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung erfolgen könnte. Es wird davon ausgegangen, dass die inaktive Form von OPR3 ein Homodimer darstellt, das durch Phosphorylierung stabilisiert wird. Weiterhin wird angenommen, dass in Antwort auf einen Stimulus dieses Dimer durch posttranslationale Modifikation (z. B. Dephosphorylierung an Position Y365) in ein aktives Monomer übergeht und anschließend, wenn es nicht mehr benötigt wird, durch Phosphorylierung erneut dimerisiert. In dieser Arbeit konnte mittels zweier Fluorophor-basierender Methoden (BiFC und FRET) die Dimerisierung der OPR3 aus Arabidopsis thaliana sowohl in Zwiebelepidermiszellen als auch in unterschiedlichen Organen von Arabidopsis beobachtet werden. OPR3-Varianten (AtOPR3E292K und AtOPR3Y365F) zeigten ein verringertes Dimerisierungspotential. Damit wurden zum ersten Mal die Homodimerisierung der OPR3 in vivo und die Bedeutung einzelner Aminsosäuren für die Dimerisierung nachgewiesen. Die Hypothese einer reversiblen OPR3-Dimerisierung und Aktivierung der JA-Synthese durch Bildung des OPR3-Monomers konnte durch zwei entscheidende Beobachtungen erhärtet werden. Sowohl nach Verwundung, als auch während der frühen Phasen der Antherenentwicklung, in denen Pflanzen JA benötigen, verschob sich das Monomer/Dimer Gleichgewicht von OPR3 in Richtung des Monomers. Dass eine posttranslationalen Modifikation für die OPR3-Dimerisierung notwendig ist, steht in Einklang mit der Beobachtung, dass OPR3 bei Expression in S. cerevisiae nicht in der Lage ist zu dimerisieren. Offenbar erfordert die Dimerisierung weitere Faktoren, die in Hefezellen nicht vorliegen. Eine Proteinkinase, welche für diese posttranslationale Modifikation der OPR3 verantwortlich ist, wurde in dieser Arbeit nicht identifiziert. Doch der Nachweis einer OPR3-Dimerisierung im Cytosol führte zu der Schlussfolgerung, dass die Kinase nicht notwendigerweise peroxisomal lokalisiert sein muss und dass die Suche auf cytosolisch lokalisierte Proteinkinasen ausgeweitet werden kann. SUMMARY Jasmonic acid (JA) is a phytohormone which plays an important regulatory role in abiotic and biotic stress responses as well as in several plant developmental processes. 12-oxophytodienoic acid reductase 3 (OPR3) contributes to jasmonic acid biosynthesis and catalyzes a critical step in peroxisomes: the conversion of the jasmonic acid precursor 12-oxophytodienoic acid (OPDA) to OPC-8:0. After wounding or herbivory JA and its bioactive form JA-Ile accumulate within a few minutes. This fast and transient increase can be explained by posttranslational activation of biosynthetic enzymes. The observation that OPR3 crystallizes as a self-inhibited dimer led to the hypothesis that the rapid JA burst is mediated by reversible dimerization of OPR3, which may be regulated by phosphorylation and dephosphorylation of the enzyme. It is postulated that the inactive form of OPR3 represents a homodimer, stabilized by phosphorylation. Furthermore it is assumed that in response to a stimulus this dimer dissociates into active